A lo largo del pasado año hemos escuchado hablar en múltiples ocasiones de la utilidad de los test PCR para diagnosticar contagios por el virus SARS-CoV-2. Se trata de una prueba clínica tremendamente útil, ya que permite detectar la presencia del virus en el organismo aunque el paciente no presente síntomas, y es un test altamente específico. En este artículo explicaremos en qué consisten los test PCR y qué otras aplicaciones tienen además de la detección de agentes infecciosos.
PCR: La reacción en cadena de la polimerasa
Las siglas PCR corresponden a la expresión inglesa “polymerase chain reaction”, que se traduce como “reacción en cadena de la polimerasa”. Fue inventada en 1983 por Kary Mullis al que le dieron el premio Nobel en 1993.
La polimerasa es una enzima cuya función es realizar copias de un fragmento de ADN a partir de una secuencia conocida. Esta secuencia conocida, llamada primer, cebador o iniciador, es una cadena corta de ADN que se añade a la muestra a la que se va a realizar la PCR.
Así, lo necesario para que se produzca la reacción en cadena de la polimerasa es: la muestra de ADN que se va a analizar, la enzima polimerasa, el cebador con la secuencia molde de ADN y los componentes estructurales del ADN para que la enzima pueda sintetizar las copias que se desean obtener.
Si la muestra de ADN analizada contiene una secuencia complementaria a la del cebador, entonces se producirá la reacción en cadena y se generarán copias del segmento de ADN que se desea obtener. Una vez finalizada la reacción, se verifica si el resultado es positivo comprobando si se ha sintetizado ADN, o por el contrario la muestra solo contiene los fragmentos iniciales.
Para ello se utiliza una técnica denominada electroforesis en gel, que permite separar moléculas en base a su tamaño. De esta forma es posible determinar si se han producido nuevas copias de ADN, lo que significaría que la PCR es positiva y el ADN contiene la secuencia de interés.
También es posible emplear el análisis PCR para detectar la presencia de secuencias de ARN. El ARN es un ácido nucleico que tiene un papel de intermediario entre el ADN y la síntesis de proteínas. Algunos virus, como el VIH, los influenzavirus causantes de la gripe o el SARS-CoV-2 poseen ARN en lugar de ADN como material genético.
Para la realización de una PCR sobre ARN es necesario un paso previo de transformación del ARN a ADN mediante la enzima transcriptasa inversa, también llamada retrotranscriptasa. Por este motivo, a esta técnica se le llama RT-PCR aunque habitualemente se utiliza PCR a secas.
Sensibilidad y especificidad de la técnica
Los análisis PCR se caracterizan por una gran sensibilidad y especificidad. La sensibilidad se refiere a que la reacción requiere una cantidad pequeña de ADN para ocurrir, y este ADN puede estar parcialmente degradado.
La sensibilidad está relacionada con los falsos negativos, ya que si el test fuera poco sensible una muestra podría contener material genético del virus pero el resultado sería negativo, al no producirse la amplificación de ADN.
La especificidad se refiere a que solo una muestra que coincida exactamente con la secuencia aportada en los cebadores debe desencadenar la amplificación de ADN, o de lo contrario se produciría un falso positivo.
Usos habituales de los test PCR
Como ya se ha explicado, la técnica PCR permite identificar la presencia de secuencias conocidas de ADN (o ARN, en el caso de algunos virus) en una muestra. Esto tiene importantes aplicaciones médicas, pues permite diagnosticar una infección vírica antes de que el paciente muestre síntomas.
Además, en una única muestra es posible detectar la presencia de varios virus, al añadir los cebadores correspondientes en una única PCR. Así, es común el uso de esta técnica para detectar casos de VIH o Hepatitis B. Una aplicación de estos test es verificar la salud de los donantes de sangre.
También son empleados test PCR para detectar enfermedades genéticas hereditarias asociadas a secuencias de ADN ya conocidas. Estas pruebas se pueden realizar en los padres, para saber si son portadores de una enfermedad, o bien realizarse en muestras de líquido amniótico para analizar el ADN del embrión.
Además de su uso en medicina, la técnica PCR es de gran utilidad en arqueología y paleontología, pues su gran sensibilidad la hace útil a la hora de estudiar restos de ADN preservados en tejido momificado, restos óseos o incluso dentro de ámbar (en lo cual se basa el argumento de las películas Parque Jurásico). Como explicábamos en otro artículo, esta técnica permite determinar el organismo patógeno responsable de epidemias de siglos pasados, al analizar los restos de material genético que se conservan.
La PCR es de gran utilidad en distintos campos de las ciencias biológicas, pues permite estudiar con precisión las secuencias de ADN presentes en una muestra. En bioquímica esto es útil para estudiar la presencia de genes concretos en poblaciones bacterianas, y la evolución que han sufrido dichos genes. En Botánica permite estudiar la evolución de distintas especies vegetales, o de variedades dentro de una misma especie. Esto último tiene importantes aplicaciones en agricultura.
Finalmente, otro uso de los análisis PCR es determinar el grado de parentesco entre dos individuos. Esto requiere un tratamiento previo de la muestra en el que el ADN es cortada en pequeños fragmentos mediante enzimas y estos fragmentos son unidos con unos cebadores de PCR que se asocian a secuencias polimórficas que son diferentes para cada individuo y heredables. Así, existe una correlación entre estas secuencias en individuos emparentados. Esto también permite la identificación de muestras de sangre, saliva u otros restos biológicos con la persona a la que pertenecen, algo muy útil en técnicas forenses para identificar un cadáver o al autor de un crimen.
Fuentes:
- Bartlett & Stirling (2003). A Short History of the Polymerase Chain Reaction. In: Methods Mol Biol. 226:3-6.
- PCR Applications. Protocols for functional genomics. Capítulo 14. Edited by Michael A. Innis, David H. Gelfand, John J. Sninsky. ISBN 0-12-372186-5, Academic Press 1999
- Kuiper M & Zabeau M 1995. AFLP: A new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23:4407-4414.
- Raoult D, Aboudharam G, Crubézy E, Larrouy G, Ludes B, Drancourt M (November 2000). «Molecular identification by «suicide PCR» of Yersinia pestis as the agent of medieval black death». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23): 12800–3.
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