método sanger

Método de secuenciación de Sanger

En un artículo previo sobre el Proyecto genoma humano hablábamos de la proeza que supuso la obtención de la secuencia completa de nuestro genoma, así como sus aplicaciones. Para ello fue necesario determinar el orden de los nucleótidos que componen el ADN, lo cual requirió un esfuerzo considerable por parte de varias Universidades y centros de investigación a lo largo de una década. En este artículo explicaremos cual fue la primera técnica desarrollada que permitía la secuenciación de genes, el método de Sanger y que hoy por hoy sigue siendo el más preciso.

Nociones básicas sobre el ADN

Repasemos primero unas nociones generales. El genoma es el conjunto de genes de un organismo o especie. Estos se encuentran codificados en el ácido desoxirribonucleico (ADN), que está formado por cuatro tipos de subunidades, llamadas bases nitrogenadas. Las bases nitrogenadas del ADN son la adenina, timina, citosina y guanina. Cada secuencia de ADN que codifica una proteína se denomina gen. 

secuenciación del adn por el método de sanger
Imagen 1. La estructura del ADN es de una doble hélice formada por dos cadenas complementarias. Cada una de las cadenas, también llamadas hebras, está formada por una secuencia de nucleótidos.

El ADN es una doble cadena en forma de hélice, a cada lado de la cadena hay dos bases nitrogenadas complementarias: la adenina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina. Por lo tanto, si sabemos que en un punto de una de las dos cadenas hay una citosina, sabemos que en ese mismo punto de la cadena complementaria hay una guanina. Esto es importante para entender el método de secuenciación desarrollado por Sanger.

El método de Sanger

Frederick Sanger fue un bioquímico británico, que recibió el premio Nobel de química en 1958 por sus investigaciones sobre la estructura de las proteínas, y en 1980 recibió un segundo Nobel en química por el desarrollo de la primera técnica de secuenciación de ADN. Sus hallazgos sobre la secuenciación del ADN fueron publicados en 1975 y supusieron el inicio de numerosas investigaciones genéticas.

Secuenciación de Sanger

El método de secuenciación de Sanger partía de una única hebra de ADN, que habría sido separada previamente de su hebra complementaria. El proceso de síntesis de ADN es realizado por la enzima polimerasa (de la cual hablamos en este artículo sobre los test PCR), que es añadida a la hebra de ADN que se quiera secuenciar. La polimerasa, en presencia de una hebra de ADN, una secuencia a partir de la cual inicial la síntesis (llamada “cebador”) y bases nitrogenadas, es capaz de sintetizar la hebra complementaria de ADN.

¿Cómo obtener la secuencia de la hebra de ADN que se está sintetizando? Deteniendo la síntesis de ADN de forma que conozcamos cuál es el último nucleótido que ha sido añadido a la cadena, y poniendo las numerosas cadenas incompletas de diferente longitud en orden.

Para ello se realiza la síntesis de ADN en cuatro reacciones separadas. A cada una de ellas se añaden los cuatro nucleótidos, y un didesoxinucleótido (adenina, timina, citosina o guanina). Los didesoxinucleótidos carecen de una molécula que es necesaria para que la síntesis de ADN pueda continuar, de forma que cuando uno es añadido a la cadena, la síntesis se detiene y la hebra queda incompleta.

electroforesis para la secuenciación de sanger
Imagen 2. Los geles de acrilamida permiten ordenar moléculas por tamaño o peso molecular. Las diferentes moléculas aparecen ordenadas en el gel formando bandas (en esta imagen se pueden apreciar dos bandas, en la parte superior derecha). El resultado del método de secuenciación de Sanger serían marcas ordenadas en el gel, que indicarían el último nucleótido añadido a la secuencia.

En cada una de las cuatro reacciones se añade una concentración del didesoxinucleótido 100 veces inferior a la del nucleótido correspondiente. Esto facilita que se produzcan secuencias de la cadena de ADN de diferente longitud, pero sin forzar a que la hebra sea demasiado corta como para que la secuenciación se vuelva un proceso demasiado tedioso.

Una vez la reacción ha terminado, las cuatro muestras son colocadas en un gel de acrilamida, que mediante la aplicación de electricidad es capaz de separar moléculas de diferente tamaño (electroforesis). Esto permite ordenar las hebras incompletas de ADN por longitud y conocer la secuencia de nucleótidos. Se trataría, eso sí, de la secuencia complementaria a la hebra que se usó como molde para la síntesis de ADN.

Esta era la forma en la que Sanger desarrolló originalmente su método de secuenciación, para lo cual debía realizar las pruebas manualmente sin ninguna automatización. Los avances tecnológicos han permitido realizar la secuenciación por este método de forma mucho más rápida y eficiente. Por ejemplo, usar diferentes tintas para marcar los cuatro didesoxinucleótidos, lo que permiten realizar la secuenciación con una única reacción en lugar de cuatro.

El procedimiento original permitía secuenciar unos 80 nucleótidos de cada vez. Suponía un gran avance respecto a las tecnologías previas, pero secuenciar genes completos podía resultar tedioso. El primer genoma completamente secuenciado de un organismo, el del bacteriófago Phi-X174, se obtuvo gracias a esta técnica en 1977. El genoma de este bacteriófago se encuentra ordenado en 11 genes y tiene un total de 5.386 bases nitrogenadas.

Fuentes

  1. Sanger F, Coulson AR (1975), A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase, Journal of Molecular Biology, 94 (3): 441–448, doi:10.1016/0022-2836(75)90213-2PMID 1100841.
  2. Sanger F et al. (1977).Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA, Nature, 265(5596):687-95

Rubén Portela
Biólogo, doctorado en ecología por la Universidad de A Coruña. Apasionado por la ciencia y enamorado desde la infancia de la naturaleza y los animales, especialmente la biología marina y los insectos.