Deuteromicetes: modelo experimental

Características generales de los Deuteromicetes

Es un grupo enorme de organismos, de alrededor de 15.000 especies conocidas según el Dictionary of the Fungi (1997). Es un grupo artificial en el que muchos son anamorfos de Ascomicetes por lo que actualmente se adopta el nombre de hongos mitospóricos.

Su morfología es sencilla, forman hifas con paredes celulares septadas. Su ciclo biológico también es sencillo: las esporas producen hifas, que a su vez forman el micelio, en este estado se forman los conidióforos que producen nuevamente esporas.

Tienen un gran número de hábitats y modos de vida con todo tipo de interacciones entre ellos. Pueden ser neutras, positivas o negativas.

Estos hongos pueden ser tanto saprotrofos como necrotrofos (obligados o facultativos) y biotrofos (obligados o facultativos). Todos suelen crecer muy bien en cultivo puro salvo los biotrofos obligados.

Importancia de los deuteromicetes (ascomicetes) en actividades humanas

• HONGOS PATÓGENOS VEGETALES: pueden atacar a cualquier especie, tanto herbácea como arbórea, fundamentalmente a las partes aéreas. Ejemplos de estos hongos son: Botrytis cinerea , Aternaria , Penicillium vermoesenii
• HONGOS COMO AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO DE PATÓGENOS: los patógenos pueden ser insectos, nematodos, otros hongos. El problema está en que no se conocen bien los antagonistas y por tanto se dificulta este uso. Ejemplos son: Paecilomyces , Verticillium chlamydosporium , Trichoderma .
• HONGOS SIMBIONTES MUTUALISTAS: simbiontes de plantas y animales, y sirven para mejorar el rendimiento, un ejemplo son las micorrizas.
• HONGOS EMPLEADOS EN LA PRODUCCIÓN Y PROCESO DE ALIMENTOS: producen las proteínas añadidas a preparados dietéticos ( Fusarium graminearum ), para la producción de proteínas (enzimas) como amilasas, celulasas, catalasas, lactosas, lipasas, etc. También se usan en la fabricación de algunos quesos ( Penicillium camembertii ), en la podredumbre noble que aumenta la calidad de algunos vinos ( Botrytis cinerea ). Y las levaduras empleadas en la fabricación de pan y repostería en general así como la fabricación de bebidas y zumos.
• HONGOS PRODUCTORES DE FÁRMACOS-MEDICINA: las penicilinas ( Penicillium chrysogenum ), cefalosporina ( Cephalosporium acremonium ), la ciclosporina (inmunosupresor empleado en transplantes extraído de Cylindrocarpon lucidum y Tolypocladium inflatum ).
• HONGOS DESCOMPONEDORES: desempeñan un papel muy importante en las redes tróficas: en los ciclos de nutrientes que son la base de las redes tróficas y en el biodeterioro de alimentos o materiales.

Biología y modo de acción Botrytis cinerea

El punto de partida para realizar un estudio acerca de un hongo patógeno puede ser cualquier enfermedad nueva producida por un hongo (fitopatógeno).

Para esto es fundamental tener en cuenta la definición de enfermedad que es una anormalidad estructural y/o funcional de una planta como resultado de su interacción con un patógeno. La anormalidad está caracterizada por ciertos síntomas y signos. Entendemos por síntomas la manifestación externa de un desarrollo, fisiología o comportamiento anormal de una planta en respuesta a una enfermedad. Los síntomas implican cambios de color, forma, olor, textura o integridad estructural. Los signos son cualquier estructura vegetativa o reproductora de un patógeno, que en el caso de los hongos es la producción de micelio, esporas, etc. Si la enfermedad posee signos es una enfermedad biótica, si no los tiene es abiótica.

El segundo paso es la observación de los síntomas y los signos. Tiene que ser una observación en el campo (con una lupa), que nos permite ver si la enfermedad es producida por un hongo, y la sintomatología como las manchas necróticas (lesiones locales), hidrópica (cambios de color en el tejido), podredumbre, etc. Después se realiza la observación en el laboratorio, con lupas y microscopios; y el aislamiento del patógeno.

El tercer paso sería ver la asociación entre la enfermedad y el patógeno. Para ello se siguen los postulados de Koch (ver si los síntomas son producidos por el signo):

• Aislamiento el patógeno del huésped (esterilizado con hipoclorito sódico al 1%).
• Crecimiento en cultivo puro (PDA, CMA, .).
• Inoculación en el huésped.
• Reaislamiento en cultivo puro.

Si los segundos síntomas se parecen a los primeros, y las estructuras del patógeno son semejantes, ese patógeno está asociado a esa enfermedad.

Después se identifica el patógeno y se pide la confirmación a un especialista.

Sabemos que es una enfermedad biótica causada por Botrytis cinerea en el huésped Gerbera jamesonii que son rosas ornamentales. Del estudio en laboratorio se concluyó que:

B. cinerea se aisló de lígulas dañadas de Gerbera , se creció en cultivo puro (formó hifas, conidióforos y conidios) y después de reinocular flores sanas, provocó los síntomas iniciales en las lígulas y pudo ser reaislado. Con lo que se sabe que es un patógeno. Puesto que puede ser crecido en cultivo en medios artificiales, se deduce que no es un patógeno obligado.

Después hay que buscar en la bibliografía la biología de B. cinerea y se busca: el ciclo biológico y el hábitat y modo de acción. Conocemos el ciclo biológico y con respecto a lo segundo encontramos que: es un hongo polífago que causa enfermedades en más de 200 huéspedes incluyendo herbáceas y arbóreas. En las herbáceas puede atacar a todas las partes aéreas del huésped: tallo, hojas, flores y fruto. También es un importante patógeno post-recolección (crece en las cámaras climáticas y ocasiona grandes pérdidas económicas). También es necesario buscar (si lo hay) algún trabajo o bibliografía específica.

Como queremos saber la biología y el modo de acción del hongo causante de la enfermedad estudiada hay que crear un modelo para el trabajo en laboratorio e invernadero. O al menos debe reproducir la sintomatología observada en condiciones naturales.

Hay que aplicar métodos y técnicas diversas:

• Observación mediante microscopía óptica y de barrido (SEM).
• En el proceso experimental hay que inocular las flores con distintos inóculos e incubarlas en distintas condiciones (en este caso de humedad).
• Las técnicas a utilizar son: medios de cultivo, siembras ( en medios, en el huésped), el manejo del inóculo, la recogida de conidios secos. Y usar cámaras húmedas y/o cámaras de crecimiento (termohigrómetro).

El trabajo experimental llevado a cabo fue en laboratorio y en invernadero. Los dos patrones que se utilizaron fueron si el inóculo era una suspensión de conidios o conidios secos, y el efecto de la humedad. Así se realizaron estudios comparativos. El método de inoculación también fue un parámetro: fumigación, espolvoreo, etc.

Las conclusiones que se obtuvieron fueron:

• La enfermedad se produce por penetración del patógeno al inocular el huésped con conidios secos y posterior incubación a humedad relativa del 100 % (agua libre).
• A humedad relativa del 60-70% (no se forma agua libre), el patógeno no produce la enfermedad sino que permanece latente.

Estos estudios trajeron como consecuencia una innovación técnica: la torre de inoculación pues era más fiable para el trabajo estadístico.

También se tuvo en cuenta el efecto de la temperatura. El trabajo experimental consistió en la inoculación de flores e incubación a distintas temperaturas. Las conclusiones fueron:

• La enfermedad se produce entre 4 y 25 ºC pero no a 30 ºC . La incubación a 30 ºC durante 7 días resulta letal para el patógeno.
• A 4 ºC los primeros síntomas visibles tardan entre 2 y 3 días en aparecer (mancha hidrópica que da lugar a la podredumbre de la lígula).
• A 20- 25 ºC es la temperatura óptima de Botrytis cinerea con lo que los primeros síntomas tardan menos de 24 horas en aparecer ( necrosis, reacción hipersensible y se localiza la infección).

La latencia de Botrytis cinerea también fue estudiada, y se llegó a la conclusión de que ante condiciones adversas como humedad baja, puede permanecer en estado latente sobre el huésped y no pierde su patogenicidad.

Los estudios histopatológicos de la infección se hicieron a nivel de microscopio óptico y de barrido. Se observó la sintomatología y el tiempo de aparición de la enfermedad. Los resultados fueron:

• La incubación a 20- 25 ºC durante 10 horas, los primeros síntomas visibles son con la lupa o el microscopio óptico: 1-2 células epidérmicas de la lígula, se acumulan polifenoles, en la pared celular se acumula calosa y después se lignifica. Se produce una reacción hipersensible-necrosis. Botrytis cinerea produce un corto tubo germinativo, invagina y penetra directamente sin formar apresorios. La infección permanece localizada en la pared de la célula epidérmica y no se aprecia penetración del hongo en el citoplasma.
• La incubación a 4ºC , los primeros síntomas aparecen a los 2 ó 3 días. Son manchas hidrópicas que al crecer originan la podredumbre de la lígula. Botrytis cinerea produce un corto tubo germinativo, invagina y penetra directamente sin apresorios. En la célula epidérmica forma estructuras engrosadas semejantes a haustorios y desde estas estructuras sigue invadiendo todo el tejido de la lígula. Al final del proceso el hongo esporula sobre la lígula produciendo nuevo inóculo.

Así se pueden realizar una serie de recomendaciones al agricultor:

• En invernadero, retirar las hojas caídas del cultivo y todo tipo de materia orgánica donde el hongo pueda esporular.
• Mantener la parte aérea del cultivo lo más seca posible (riego por goteo).
• Evitar que se produzca condensación sobre el cultivo por cambios bruscos de temperatura (ventilar y/o calentar el invernadero al amanecer o anochecer).

Biologíay modo de acción Penicillium vermoesenii

Están asociados a enfermedades producidas en palmáceas. (podredumbre rosa, fue la enfermedad utilizada como punto de partida). El patógeno en este caso se mandó a un experto para determinarlo correctamente. Este patógeno es vascular, es decir, se propaga a través de los vasos. Su hábitat es el suelo e inician la infección por la raíz pero en este caso no ocurre eso. No es un biotrofo porque se aisló en cultivo puro (agar con extracto de maíz). Su ciclo biológico es el típico de Deuteromicetes.

Para asociar la enfermedad con el hongo se utilizaron los postulados de Koch, y se comprobaron. Se llegó a las siguientes conclusiones:

1. Penicillium vermoesenii se aisló de peciolos de Washingtonia filifera atacada por el hongo, se creció en cultivo puro (formó hifas, conidióforos y conidios) y después de reinocular en el huésped, provocó los síntomas observados inicialmente en él y pudo ser reaislado con lo que se concluyó que era un patógeno.
2. Puesto que puede ser crecido en medios artificiales, se deduce que no es un patógeno obligado.

Posteriormente al buscar en la bibliografía se encontró lo siguiente. Su hábitat es muy específico, se confundió con Gliocladium vermoesenii pero no era éste sino Penicillium.

En 1990 se detectó en España (Islas Canarias) por primera vez en Phoenix canariensis y posteriormente fue citado por Gallego et al., como el agente causal de la podredumbre rosa en palmáceas del sudoeste español. Los síntomas típicos son manchas hidrópicas que se van necrosando paulatinamente y necrosis en hojas jóvenes. En condiciones de alta humedad el hongo esporula profusamente y aparece como un polvillo rosa sobre el tejido atacado. Hay poca bibliografía específica de este hongo y por ello se realizó primero un estudio histológico (de palmeras sanas y enfermas), aquí se trabajó con las palmeras ( Washingtonia filifera ) del campus (hilera del polideportivo). Para ello se utilizó microscopía, se inoculó de distintos modos (peciolos con y sin herida, siembras en cultivos y en el huésped), pues es un patógeno oportunista y sólo penetra a través de las heridas aprovechando situaciones como la poda para penetrar. El inoculo se realizó con esporas de Penicillium vermoesenii .

Los estudios histológicos revelan el efecto del patógeno. Se observan necrosis celulares, hifas del hongo, etc. En los vasos ocurren oclusiones por el crecimiento del hongo, pues se observa el micelio del hongo que ha crecido en los vasos del xilema en el interior. También se observan formaciones de mucílago en los vasos y desorganización.

En cuanto a su biología y modo de acción, probablemente primero coloniza células parenquimáticas y después se va a los vasos (del xilema) y a partir de allí se extiende a los tejidos del huésped colonizándolo y produciendo la necrosis del tejido afectado. Por ello se cree que es un patógeno vascular, pero en ellos raramente se ve necrosis, lo que sí se aprecia es un cambio de color. También parece un patógeno vascular por la respuesta que produce el huésped (en los tejidos infectados hay mucílago que bloquea los vasos y está presente en el parénquima), para que sea vascular el hongo debe esporular en los vasos y estas esporas se transmiten al resto de la planta. En Penicillium vermoesenii no se aprecia esta esporulación en los vasos. Lo que sí está claro es que es un patógeno oportunista de heridas con características de patógeno vascular y necrotrofo.

Control biológico de Penicillium vermoesenii

Primero se seleccionan antagonistas mediante enfrentamientos en placa, para ello se estudiaron los que provocaban retardo y/o inhibición del crecimiento del hongo diana Penicillium vermoesenii . Se utilizaron también microparásitos (hongos que parasitan a otros hongos). Al final se eligió Trichoderma harzianum que se aisló en Washingtonia : formaba arrollamientos y penetraba en Penicillium vermoesenii y lo colonizaba destruyéndolo finalmente. Ambos hongos son Deuteromicetes y suelen vivir en el suelo.

Para el control de la podredumbre rosa se realizaron experimentos en el campo y en el laboratorio. Primero se esterilizó la superficie del peciolo de la planta para producir un corte de 2 cm de profundidad e introducir el inóculo. El material debe estar intacto aunque sea obtenido en el campo porque puede tener otros organismos que nos alteren el experimento. Los tratamientos fueron:

• Intacto (control)
• Herida + agua (control)
• Herida + Penicillium vermoesenii
• Herida + antagonista
• Herida + Penicillium vermoesenii + antagonista ( efecto curativo)
• Herida + antagonista + Penicillium vermoesenii

En los controles no aparecieron síntomas y esto fue una suerte ya que no se aisló el patógeno. También comprobaron que el antagonista entraba bien en el patógeno y el efecto que esto producía en la planta. También se tuvieron en cuenta si se quería probar en método preventivo (antes de) o curativo (después de). También se comparó el efecto del hongo antagonista con fungicidas ya conocidos como procloraz, metil-tiofanato, carbenzadima. Hubo de llevar cuidado para que el patógeno no se propagara por toda la palmera ya que el material es muy caro.

Cuando se infecta primero aparece una mancha hidrópica y después una necrosis, aunque también hay tejido no afectado. También se cortaron trocitos de las zonas que presentaban síntomas para comprobar si contenían el patógeno.

Se probaron fungicidas varios y se comprobó su eficacia para ver si los antagonistas tenían un efecto similar. Se observó que con los antagonistas el método preventivo tiene la misma eficacia que con los fungicidas. Con los métodos curativos los resultados fueron buenos en laboratorio pero en el campo probablemente hubieran sido negativos.